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發(fā)布于 2023-08-11
提到細胞凋亡，想必大家都不陌生，咱們這個(gè)領(lǐng)域的，先不說(shuō)本科的時(shí)候學(xué)過(guò)，考研的時(shí)候怎么說(shuō)它也是重要考點(diǎn)之一?；蛟S此時(shí)您的腦袋瓜子里立馬浮現出課本上那個(gè)經(jīng)典的凋亡信號通路圖......額，還有點(diǎn)記不清......沒(méi)關(guān)系，今天小編帶您回顧一下經(jīng)典的細胞凋亡信號通路，再看看它常見(jiàn)的檢測方法。
☆細胞凋亡
·細胞凋亡是一種細胞主動(dòng)有序的死亡，它涉及一系列基因的激活、表達以及調控等作用，它并不是病理條件下自體損傷的一種現象，而是為了更好地適應生存環(huán)境而主動(dòng)爭取的一種死亡。
·細胞凋亡相關(guān)信號通路
凋亡信號通路主要包括Caspase依賴(lài)型細胞凋亡和Caspase非依賴(lài)型細胞凋亡。
☆細胞凋亡常用檢測方法
想要了解凋亡常用的檢測方法，首先要知道凋亡的形態(tài)學(xué)變化。形態(tài)學(xué)觀(guān)察細胞凋亡的變化是多階段的，細胞凋亡往往涉及多個(gè)細胞，即便是一小部分細胞也是非同步發(fā)生的。首先出現的是細胞體積縮小，連接消失，與周?chē)募毎撾x，然后是細胞質(zhì)密度增加，接下來(lái)會(huì )發(fā)生一系列的變化：線(xiàn)粒體膜電位消失；通透性改變；釋放細胞色素C到胞漿；核質(zhì)濃縮，核膜核仁破碎；DNA降解成為約180bp-200bp片段，胞膜有小泡狀形成；膜內側磷脂酰絲氨酸外翻到膜表面；胞膜結構仍然完整，最終可將凋亡細胞遺骸分割包裹為幾個(gè)凋亡小體，無(wú)內容物外溢。
細胞凋亡檢測通常有形態(tài)學(xué)觀(guān)察方法、DNA凝膠電泳、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)核小體測定、流式細胞儀定量分析、Western blot檢測等。
（1）形態(tài)學(xué)觀(guān)察
電鏡觀(guān)察：可見(jiàn)凋亡細胞表面微絨毛消失，核染色質(zhì)固縮、邊集，常呈新月形，核膜皺褶，胞質(zhì)緊實(shí)，細胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小體及凋亡小體被臨近吞噬細胞吞噬現象。
（2）DNA凝膠電泳
細胞凋亡時(shí)主要生物化學(xué)特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮，染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接處斷裂，形成180~200bp整數倍的寡核苷酸片段，在凝膠電泳上表現為梯形電泳圖譜（DNA ladder）。通過(guò)提取DNA、電泳、UV下可見(jiàn)DNA ladder。此方法是判斷細胞有無(wú)凋亡發(fā)生的一種簡(jiǎn)便方法，比較適用于體外培養的非增殖性細胞的檢測。
（3）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)核小體測定
凋亡細胞的DNA斷裂使細胞質(zhì)內出現核小體。核小體由組蛋白及其伴隨的DNA片斷組成，可由ELISA法檢測。
檢測步驟
① 將凋亡細胞裂解后高速離心，其上清液中含有核小體；
② 在微定量板上吸附組蛋白體；
③ 加上清夜使抗組蛋白抗體與核小體上的組蛋白結合；
④ 加辣過(guò)氧化物酶標記的抗DNA抗體使之與核小體上的DNA結合；
⑤ 加酶的底物，測光吸收值。
此方法優(yōu)點(diǎn)：敏感性高、應用廣泛、操作簡(jiǎn)單；缺點(diǎn)：不能精確定量。
（4）Annexin V/PI法
正常細胞中，磷脂酰絲氨酸（phosphotidylserine，PS）位于細胞膜的內側，但在早期凋亡細胞中，PS會(huì )從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環(huán)境中。Annexin-V（膜聯(lián)蛋白-V）是一種分子量為35-36KD的Ca2+依賴(lài)性磷脂結合蛋白，能與PS高親和力結合。用熒光素（FITC、Alexa Fluor488等）標記的Annexin-V作為探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料，它不能透過(guò)完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和壞死細胞，PI能夠透過(guò)細胞膜而將細胞核染紅。因此將Annexin-V與PI結合使用，就可以檢測出細胞群體中的早期凋亡細胞與晚期凋亡細胞
（5）TUNEL法
細胞凋亡中，染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）的作用下將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3'末端，從而可進(jìn)行凋亡細胞的檢測，這類(lèi)方法稱(chēng)為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（TUNEL）。
常用的標記系統：生物素標記的dUTP、地高辛標記的dUTP、熒光素標記的dUTP、溴分子標記的dUTP；
常用的顯色系統：Anti-biotin/digoxin/biotin- HRP和DAB；FITC-dUTP/BrdU和流式細胞儀。
（6）Western blot檢測
分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及對底物多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]等的裂解。
Caspase家族在介導細胞凋亡的過(guò)程中起著(zhù)非常重要的作用，其中caspase-3為關(guān)鍵的執行分子，它在凋亡信號傳導的許多途徑中發(fā)揮功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段被激活，活化的Caspase-3由兩個(gè)大亞基（17KD）和兩個(gè)小亞基（12KD）組成，裂解相應的胞漿胞核底物，最終導致細胞凋亡。但在細胞凋亡的晚期和死亡細胞，caspase-3的活性明顯下降。
（7）熒光分光光度計分析
活化的Caspase-3能夠特異切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽鍵。根據這一特點(diǎn)，設計出熒光物質(zhì)偶聯(lián)的短肽Ac-DEVD-AMC（caspase-3四肽熒光底物 ）。在共價(jià)偶聯(lián)時(shí)，AMC不能被激發(fā)熒光，短肽被水解后釋放出AMC，自由的AMC才能被激發(fā)發(fā)射熒光。根據釋放的AMC熒光強度的大小，可以測定caspase-3的活性，從而反映Caspase-3被活化的程度。
（8）其他凋亡相關(guān)因素分析
1）△Ψm dissipation（線(xiàn)粒體跨膜電位的消失）：TMRM（發(fā)紅色熒光），細胞膜熒光探針DiOC6（3），碘化物（發(fā)綠色熒光）、Rhodamine 123（發(fā)黃綠色熒光）、JC-1（單體形式綠色熒光；多聚體形式紅色熒光）【abs50016-100T：線(xiàn)粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)】，這些染料對線(xiàn)粒體膜電位非常敏感，其熒光的增強或減弱說(shuō)明線(xiàn)粒體內膜電負性的增高或降低。
2）細胞內氧化還原狀態(tài)改變的檢測：通過(guò)熒光染料Monochlorobimane（MCB）體外檢測凋亡細胞細胞質(zhì)中谷胱甘肽的減少來(lái)檢測凋亡早期細胞內氧化還原狀態(tài)的變化。
3）檢測線(xiàn)粒體產(chǎn)生的ROS：無(wú)熒光的HE（氫化乙啶）可被ROS氧化為EthBr（溴乙啡啶），發(fā)紅色熒光。NAO（烷化吖啶橙，可發(fā)熒光）能與非氧化的心磷脂（可被ROS氧化）反而失去熒光。